بیوشیمی

وب سایتی برای علاقه مندان علوم زیستی
Real-time PCR
16 مارس 10

این تکنیک کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و تحقیقات دارد. در این روش میتوان یک سکانس خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونهای مورد مطالعه اندازه گیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل، غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود. سایر نامهای این تکنیک عبارتند از quantitative real time polymerase chain reaction   و kinetic polymerase chain reaction. این تکنیک گاهی به اشتباه RT-PCR نامیده میشود که مخفف روش Reverse Transcription PCR است. ولی امروزه در دنیای تجارت و حتی مراکز تحقیقاتی بصورت یک اشتباه مصطلح در آمده است. گاهی روش Real-time PCR با رونویسی معکوس(reverse transcription) ادغام میگردد تا مقدار mRNA (messenger RNA) در سلولها و بافتها اندازه گیری شود. این تکنیک جدید، Real-time reverse-transcription PCR نامیده میشود و با علامتهای اختصاری qRT-PCR، RRT-PCRو یا  RT-rt PCR مشخص میگردد.

در تکنیک Real-time PCR، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس  استفاده میشود.

تعیین غلظت DNA با استفاده از رنگهای فلورسانس

در این تکنیک از رنگهایی استفاده میشود که پس از اتصال به ساختار دو رشته ای DNA (double-stranded:ds)، نور فلورسانس منتشر میکنند. بنابر این در طی واکنش PCR، به موازات افزایش غلظت DNA، میزان فلورسانس در محلول افزایش می یابد. با اندازه گیری شدت نور فلورسانس در انتهای هر سیکل، نهایتا یک منحنی بدست می آید. سپس با استفاده از نمودارهای استاندارد، غلظت DNAی هدف در نمونه مورد مطالعه محاسبه میشود. لازم به ذکر است که رنگهایی نظیر SYBR Green به تمام انواع DNAی دو رشته ای، ازجمله محصولات غیر اختصاصی PCR و حتی دیمرهای پرایمر (Primer dimers) نیز متصل میشوند و این موضوع موجب کاهش اختصاصی بودن (Specificity) در نتایج حاصل میشود.

تعیین غلظت DNA با استفاده از شاخص های الیگونوکلئوتیدی فلورسانس

در تکنیک Real-time PCR، دقیقترین و قابل اعتمادترین نتایج با استفاده از شاخص های گزارشگر فلورسانس بدست می آید که البته هزینه زیادی نیز در بردارد. در این روش از شاخصهای DNA یا RNA ی اختصاصی (sequence-specific RNA or DNA-based probe) استفاده میشود و در نتیجه در DNAی هدف، جستجو و تعیین غلظت برای سکانسهای خاص امکانپذیر میگردد. بنابر این حتی در حضور سایر انواع DNA، نتایج حاصل از نظر اختصاصی بودن، در حد بالائی است. در این شرایط، چنانچه از شاخصهای اختصاصی با رنگهای مختلف استفاده شود، حتی میتوان ژنهای متعددی را در یک واکنش PCR، مورد بررسی قرار داد.

کاربردهای Real-time PCR:

1. تعیین تعداد کپی از هر ژن: Wu, 2007; ABI TaqMan® Gene Copy Number Assays; Protocol for 7900HT

2. سنجش میزان بیان ژن:Giulietti, 2001 و Leung, 2005

3. بررسی صحت نتایج در آرایه ها: Rajeevan, 2001 و Verification of Array Results Page by Pfaffl

4. مطالعات ایمنی زیستی و پایداری ژنتیک: Lovatt, 2002

5. بررسی میزان اثر بخشی داروها و مانیتورینگ داروها: Leruez-Ville, 2004; Brennan, 2003; Burger, 2003; Kogure, 2004

6. انجام تکنیک Real-Time Immuno-PCR (IPCR): Adler, 2003; Barletta, 2004; Lind & Kubista, 2005

7. رسوب کروماتین با استفاده از اتصال آنتی ژن-آنتی بادی: Braveman, 2004; Sandoval, 2004; Wang, 2004; Iype, 2005; Potratz, 2005; Puppo, 2005

8. سنجش ویروسها: Niesters, 2001; Mengelle, 2003; Espy, 2006

9. شناسائی عوامل پاتوژن شامل:

شناسائی CMV: Kearns, 2001a; Kearns, 2001b; Kearns, 2002; Mengelle, 2003

تشخیص سریع آلودگی به مننگوکوک: Bryant, 2004

بررسی حساسیت استرپتوکوکوس پنومونیا به پنی سیلین : Kearns, 2002

شناسائی مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و گونه های مقاوم:  Kraus, 2001; Torres, 2003; Cleary, 2003; Hazbon, 2004

پاتوژن های میکروبی در آبهای محیطی: Foulds, 2002; Guy, 2003

10. اندازه گیری میزان آسیب به DNA: Dietmaier, 2001

11. سنجش میزان تماس با اشعه رادیواکتیو: Blakely, 2001; Blakely, 2002; Grace, 2002; Grace, 2003

12. بررسی فرآیندهای زیستی در سلولهای زنده: Tung, 2000; Bremer, 2002

13. مطالعه DNAی میتوکندریائی: He, 2002; Liu, 2003; Alonso, 2004

14. شناسائی متیلاسیون: Trinh, 2001; Cottrell, 2004; Lehmann & Kreipe, 2004; Thomassin, 2004

15. تشخیص غیرفعال شدن ژنها در کروموزوم X: Hartshorn, 2002; van Dijk, 2002

16. تعیین همسانی در لوکوسهای HLA: Zhou, 2004

17. پیگیری نتایج پیوند عضو: Sabek, 2002; Gibbs, 2003

18. پیگیری نتایج، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز: Elmaagacli, 2002; Alizadeh, 2002; Thiede, 2004; Harries, 2004

19. پیگیری عوارض باقیمانده ناشی از بیماری، پس از پیوند سلولهای بنیادی خونساز: Elmaagacli, 2002; Cilloni, 2002; Sarris, 2002; Gabert, 2003; Van der Velden, 2003

20. تعیین مقدار ژن و زیگوسیتی: (Bubner, 2004; Barrois, 2004; Chen, 2006; Szilagyi, 2006

21. ژنوتایپینگ و تشخیص انواع موتاسیونها شامل الحاق، حذف و موتاسیون نقطه ای: von Ahsen 2000; Donohoe, 2000; Lyon, 2001; Waterfall & Cobb, 2002; Bennett, 2003; Wittwer, 2003; Zhou, 2005; Palais, 2005; Chou, 2005، ; Mhlanga, 2001; Solinas, 2001; Song, 2002; Gupta, 2004; reviewed in Lareu, 2004، Kutyavin, 2000; Letertre, 2003; Johnson, 2004; Ugozzoli, 2004، Tapp, 2000

22. بررسی انواع تریزومی:  Zimmermann, 2002

23. بررسی ژنوتیپهای حاصل از حذف جزئی یا microdeletion: Laurendeau, 1999; Kariyazono, 2001; Covault, 2003; Coupry, 2004

24. هاپلوتایپینگ: Von Ahsen, 2004; Pont-Kingdon & Lyon, 2005

25. بررسی کمی میکروساتلیت ها: Ginzinger, 2000

26. تشخیص قبل از تولد و تعیین جنسیت با استفاده از سلولهای جدا شده از خون مادرHahn, 2000; Bischoff, 2002; Bischoff, 2003 یا DNAی جنینی در جریان خون مادر Bischoff, 2002; Hwa, 2004

27. تشخیص قبل از تولد برای اختلالات هموگلوبین: Kanavakis, 1997; Vrettou, 2003; Vrettou, 2004

28. تشخیص سرطان در حین عمل جراحی : Raja, 2002

29 LATE-PCR که یک نوع real-time PCR جدید است و بررسی های کمی را در مقادیر جزئی از نمونه های بیولوژیک، امکانپذیر میسازد و بتریج کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی، دفاع بیولوژیک، پزشکی قانونی و تعیین سکانس DNA می یابد: Sanchez, 2004

منابع اینترنتی برای مطالعه بیشتر در زمینه Real-Time PCR

1st International qPCR Symposium  &  Application Workshop, qPCR 2009

ABgene Dual Labeled Probe Design Guide

ABI TaqMan Human Endogenous Control Plate

ABI User Bulletins ABI-PRISM 7700 Application Notes 7900HT 7000 Compendium

AlleleID Pathogen Detection Primer & Probe Design Tool by Premier Biosoft International

Ambion TechNotes on Real-Time PCR

Applied Biosystems Sequence Detection Systems

Automated PubMed Search for Real-Time PCR

Available Real-Time PCR Platforms BioCompare

BestKeeper© for determination of stable housekeeping genes, Download

برنامه های آموزشیBiocompare

BioGene InSyte

BioInformatics in Real-Time PCR

Bio-Rad iCycler

BioTechniques Molecular Biology Forums: Real-Time qPCR

CAmpER – Real-time PCR Analysis Software

Cepheid Smart Cycler

Corbett Research Rotor-Gene

DesignMyProbe at Sigma-Aldrich

D-LUX Designer

Eppendorf Mastercycler

Essentials of Real-Time PCR Lecture by Man Bock Gu

Exiqon ProbeLibrary

EZ one-step RT-PCR kit

Five Questions on qPCR & How It Works, The Scientist

Fluidigm, high-throughput qPCR, CNV, genotyping

Frequently Asked Questions, Real-Time PCR Primers

Full qPCR Protocol (Nolan, Hands & Bustin, Nature Protocols, 2006), PDF

Gene Quantification Page by Michael W Pfaffl & Directory Page

geNORM (Vandesompele, 2002) NormFinder (Andersen, 2004) qBasePlus, Hellemans, 2007

Idaho Technology LightScannerFilmArray

Invitrogene Molecular Probes Handbook

Lab-on-a-Chip Technology: Biomolecular Separation and Analysis

Lab-on-a-Chip Technology: Fabrication and Microfluidics

LightCycler University

Light-Up Probes, 1, 2

Links at PCRlinks.com

Links at Protocol Online

LNA Primers, Exiqon OligoDesign

LNA Probes

MIQE: Minimum Information for Publication of qPCR Experiments (Checklist: XLS, PDF) – Bustin, 2009

MJ Research Real-Time Systems

Molecular Beacons

Open Access Real-time PCR Papers

PCR and Real Time PCR Links

PCR Troubleshooting: The Essential Guide

Peirson, 2003 (DART-PCR), Download

Primer Express software

PrimerDesign InVitroGene: Custom Primers-OligoPerfect™ Designer

Primer-Probe and Beacon Design Program & Demo by Premier

Products for LightCycler

Q-GENE for data processing

QiaGen Handbooks on SYBR Green Detection Systems and RT-PCR

Q-PCR Training @ TATAA BioCenter

Quantitative PCR Gene Expression Profiling by MultiD – Tutorials

Quantitative PCR Primer Database – QPPD, NCI

Real Time PCR & Quantitation Lecture by Ian MacKay

Real Time PCR Special Issue (Dec 2001, Vol.25, Issue 4) of METHODS Journal

Real-Time PCR Handbook, University of Illinois at Chicago

Real-Time PCR in Infectious Diseases (PPT) & (PDF) by Theo Sloots

Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization

Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization

Real-Time PCR Literature

Real-Time PCR Seminar (NIEHS) & Review by Nigel Walker

Real-Time PCR Tutorial, South Carolina University

Real-Time PCR: Current Technology and Applications

Real-Time PCR: Current Technology and Applications

Real-Time PCR: Short Course, University of Texas

Real-Time PCR: Understanding CT

9REST© for Relative Expression Software Tool, REST-2008 / Corbett

Review of real-time PCR in mRNA Quantitation, Wong & Medrano, 2005

Roche LightCycler Literature and Technical Notes

Roche LightCycler One-Step RT-PCR Kit

ROCHE LightCycler Online

RT-PCR Primer DataBase

RT-PCR Primer Sets

RT-PCR PrimerBank

Scorpion Technology

Setting Baselines and Thresholds

Sigma-Aldrich qPCR Technical Guide

Sigma-Aldrich qPCR Webinars

SNP500 Cancer Validated TaqMan Allelic Discrimination Assays

SNP500Cancer Validated Allelic Discrimination Assay List, including TaqMan Protocols

Statistics and Gene Expression Analysis

Stratagene Multiplex qPCR System & qPCR Guide

Stratagene Mx3000™ Multiplex Quantitative PCR System

STRATAGENE Online qPCR Training

TaqMan Gene Expression Assays

TaqMan Human Endogenous Control Plate

TaqMan Human Endogenous Control Plate

TATAA Biocenter Endogenous Control Gene Panel

TATAA Biocenter Open Courses in Quantitative PCR

Techne Quantica

Tools and Technologies for Real-Time PCR & Fast PCR, text

Tools at TATAA BioCenter & GenEx

Transcript of a Webcast on Real-Time PCR Applications, Bio.Com

Troubleshooting & Optimization Guide, Thermo Scientific

Workshops and Courses by Stephen Bustin

کتابها

(Real-Time PCR (Dorak MT

(A-Z of Quantitative PCR (Bustin S

(Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications (Wittwer Hahn, Kaul

(Real-Time PCR: An Essential Guide (Edwards, Logan, Saunders

(Real-Time PCR: Current Technology and Applications (Logan, Edwards, Saunders

(Real-time PCR in Microbiology (MacKay IM

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

شما می‌توانید از این دستورات HTML استفاده کنید: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>