بیوشیمی

وب سایتی برای علاقه مندان علوم زیستی
اسپکتروفتومتری
نویسنده:
7 سپتامبر 10

گردآورنده : شیوا ذبیحیان – پزشکی مهر 88
مقدمه:
اسپکتروفتومتری:
در روشهاي اسپکتروفتومتری (طيف سنجي)، تاثیر محلولها بر امواج الكترومغناطيسي مورد مطالعه قرار میگیرد. محدوده طيف الكترومغناطيس میتواند از اشعه ماوراء بنفش تا امواج راديويي باشد.
مقدار نور جذب شده توسط محلول، تابع قوانين Beer وLambert است و از رابطه A=e lc محاسبه مي شود. طبق قانون بیر، هر گاه یک اشعه نور تک رنگ از درون محلولی با رنگ مکمل عبور کند، مقدار نور جذب شده توسط محلول، با غلظت آن نسبت مستقیم دارد. طبق قانون لامبرت، مقدار نور جذب شده توسط لایه های مختلف محلول همواره ثابت بوده و با شدت نور تابیده شده بستگی ندارد. بر اساس قوانین بیر و لامبرت رابطه بین غلظت محلول و نور جذب شده به صورت خطی است و معمولا در محدوده اي كه جذب با غلظت رابطه خطي دارد، تعيين غلظت مواد انجام مي شود.اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزديك باشد و غلظتها هم در محدوده خطي باشند، مي توان با استفاده از تناسب محاسبات را انجام داد.
دستگاه اسپكتروفتومتر از دو بخش اسپكترومتر و فتومتر تشكيل شده است. اسپكترومتر بخشي است كه نور منوكروم را ايجاد كرده و داراي منبع نور، عدسي، شكافها، منوكروماتور (صافي یا منشور) مي باشد. بخش فتومتر داراي اسباب سنجش نور است.

با اسپكتروفوتومترآشنا شويم (سفري با سرعت نوربين آينه ها):
اسپكتروفوتومتر يا طيف سنج، دستگاهي است كه شدت نور را به صورت تابعي از طول موج اندازه‌گيري مي كند. اين كار با انكسار پرتو نور به طيف طول موج ها و آشكارسازي شدت ها با دستگاه بار دار و نمايش نتايج به صورت گراف انجام مي‌شود. در حقيقت اين روش با استفاده از ميزان جذب نور، تعيين غلظت مي‌كند. اين روش قابليت اندازه گيري نمونه هاي فوق العاده كوچك را داشته لذا از آن براي تجزيه و تحليل عناصر مولكول‌هاي‌DNA , RNA استفاده مي‌شود.
نور از بسته هاي بسيار كوچكي به نام فوتون تشكيل شده است كه انرژي هريك از آن‌ها به محض برخورد به يك الكترون منتقل مي شود. تنها هنگامي انتقال رخ مي دهد كه انرژي فوتون ها برابر با انرژي مورد نياز براي انتقال الكترون به لايه انرژي بعدي باشد. اين پروسه كه در آزمايش‌هاي محاسبه كيفيت و كميت‌DNA موجود در محلول‌ها استفاده مي شود، پايه طيف بيني جذبي را تشكيل مي دهد. به طور كلي نور با طول موج و انرژي خاص به نمونه تابانده شده و مقدار مشخصي از انرژي آن جذب مي شود. سپس با اندازه‌گيري انرژي رد شده از نمونه توسط يك فوتودتكتور، مقدار جذب تعيين مي‌شود. ‌اسپكتروفوتومتر دستگاه پيچيده‌اي‌ است كه شدت نور را به صورت تابعي از طول موج است اندازه‌گيري مي كند. در اين دستگاه نور توسط يك منبع نور توليد شده و پس از گذشتن از ميان نمونه مورد نظر نور، به صورت طيفي منتشر مي شود سپس به وسيله سنسورها آشكارسازي شده و به صورت نتايج قابل كاربردي ترجمه مي‌شود. خروجي اسپكتروفوتومتر هميشه نموداري از شدت نور نسبت به طول موج است. داده‌هايي كه براي توليد نمودار گردآوري شده، در جدولي از شدت نور و طول موج ذخيره مي‌شود. مقدار گراف بيان كننده مقدار عبور يا مقدار جذب است. اسپكتروفوتومترهاي امروزي ديجيتالي بوده و به وسيله ميكروپروسسور كنترل مي شوند.

اجزا اسپكتروفوتومتر:

چهار بخش اصلي در اسپكتروفوتومتر وجود دارد: منبع نور، نمونه، آشكارساز و مفسر. منبع نور مي‌تواند نور مرئي، مادون قرمز يا ماوراء بنفش باشد. پس از منبع نور يك تك فام ساز (مونوكروماتور) وجود دارد تا نور توليد شده را فيلتر و توسط يك منشور يا توري پراش طول موج‌هاي خاصي را انتخاب كند. پس از گذشتن نور توليد شده از داخل نمونه و جذب بخشي از آن، پس از گذشتن از مجموعه اي از لنزها، شكاف‌ها، آينه‌ها و فيلترها به سنسور‌ها رسيده و پس از تفسير شدن به صورت نموداري در خروجي قرار مي گيرد.‌

قانون بیر-لامبرت:
وقتی یک دسته امواج تک رنگ نورانی را از یک محیط وارد یک محیط یکنواخت دیگر می شود قسمتی از آن منعکس و قسمتی از آن جذب محیط دوم شده و قسمتی دیگر از آن خارج می شود.
رابطه بین شدت نور تابش شده و نور خروجی در سال 1760 توسط لامبرت بدست آمد و بیر درسال 1762 درستی آن را درباره محلول ها بررسی نمود و نتیجه گرفت که این رابطه درمورد محلول ها نیز صادق است.
بر طبق قانون لامبرت افت نسبی شدت نور نسبت به ضخامت محیط جاذب نور، با شدت نور تابش شده متناسب است.

مسير نور:
در حال حاضر دو منبع نور‌UV و‌VIS‌ براي اسپكتروفوتومتر وجود دارد. متداول ترين منبع نور براي توليد نور مرئي يك لامپ هالوژن تنگستن با طول موجي بين 200 و 340 نانومتر است. چنانكه در شكل 1 ديده مي شود نور از ميان نمونه عبور كرده و از طريق شكافي وارد اسپكتروفوتومتر مي‌شود.

شكاف نازك باعث پراكنده شدن نور و پخش به خارج مي‌شود. از آنجا كه دستگاه‌ها تنها يك باريكه نور دارند، در بيشتر موارد طول موج پرتو خوانده شده از نمونه دستخوش تغيير واقع مي شود و براي اصلاح اين امر از آينه‌هاي مقعر استفاده مي شود. بدين ترتيب كه نور توسط آينه اي مقعر به شبكه پراكننده كننده منعكس شده و دوباره به آينه مقعر ديگري منعكس مي‌شود. اين آينه كانوني نور را به سمت آشكارساز متمركز مي‌كند .‌
آينه‌هايي كه امروزه مورد استفاده قرار مي‌گيرند به سه دسته تقسيم مي شوند. اولين دسته از شيشه ساخته شده و براي خواندن جذب در طول موج هاي‌UV بيشتر از 340 نانومتر استفاده مي شود. دسته دوم از سيليس گداخته يا كوارتز ساخته شده و به علت شفافيت بسيار زياد مي‌تواند در اندازه‌گيري جذب طيف‌هاي ( UV-VIS 200 تا 800 نانومتر) استفاده شود و آخرين نوع آينه هاي يك بار مصرف است كه انواع مختلفي دارد. يك نمونه از آن از پلي متا اكريليت بوده و تنها براي اندازه‌گيري طول موج هاي 280 تا 800 نانومتر استفاده مي شود.‌
طبق آخرين تحقيقات آزمايشگاهي، منبع‌UV مي‌تواند لامپ هيدروژني فشار بالا يا لامپ دوتريوم باشد. هنگامي كه ميزان جذب در طيف‌UV اندازه‌گيري مي شود، لامپ ديگر خاموش مي شود و زماني كه اندازه‌گيري جذب در نور مرئي انجام مي شود بر عكس اين مساله اتفاق مي افتد كه دليل اين امر جلوگيري از تداخل طول موج هاي غير ضروري در نور منتشر شده از نمونه است. ‌

آشكار ساز:
در انتهاي مسير نور ، آشكار ساز وجود دارد كه وظيفه آن اندازه‌گيري شدت نور تابيده شده از آينه‌ها و انتقال اطلاعات به كنتوري است كه آن‌ها را ثبت و مقدار را بر روي‌LCD به اپراتور نمايش دهد. امروزه دو نوع آشكارساز در اسپكتروفوتومترهاي‌UV/VIS متداول است: فوتوتيوب و فوتومالتي پلاير تيوب. فوتوتيوب يا فوتوسل با توليد يك جريان الكتريكي عمل مي كند. وقتي يك فوتون به كاتد سلول ضربه بزند، الكترون به سمت آند رانده شده و بدين ترتيب جريان الكتروني به ‌وجود مي آيد كه مقدار آن به ميزان انرژي فوتون بستگي دارد. تيوب فوتومالتي پلاير كه بسيار حساس تر است به قانون اثر فوتوالكتريك پلانك استناد دارد. فوتون ها به سطح حساس تيوب ضربه زده و الكترون هاي اوليه را به حركت در مي آورد ، با برخورد اين الكترون ها با سطح بعدي الكترون هاي ثانويه نيز رها مي شوند. اين روال به همين ترتيب ادامه پيدا كرده تا به آند برسند و جريان الكتريكي راه بيفتد. جريان توليد شده چندين بار تقويت شده تا بتوان انرژي بسيار پايين يك فوتون را آشكارسازي و ثبت كرد.‌

دستگاه بار دار(CCD):
‌آشكارساز در بيشتر اسپكتروفوتومترها يك دستگاه بار دار خطي‌‌(CCD) است.‌CCD نوعي سنسور است كه نور را حس مي‌كند و از مدارهاي مجتمعي مشتمل بر جفت خازن هاي كوپل شده حساس به نور تشكيل شده است. اين خازن ها شدت نور دريافتي را حس كرده و آن‌را به سيگنال الكتريكي تبديل مي‌كند. آشكارساز خطي‌CCD مشابه دامنه طول موج‌ها در اسپكتروفوتومتر دستي است. هر پيكسل در‌CCD نشان دهنده‌ طول موج خاصي از نور است و فوتون هاي جذب شده بيشتر، سيگنال‌هاي الكتريكي بيشتري توليد مي كنند. بنابراين سيگنال‌هاي الكتريكي خروجي CCD در هر پيكسل، برابر نسبت شدت نور در طول موج متناظر است.‌

مفسر:
اسپكتروفوتومترها مي‌توانند خروجي خود را به صورت هاي مختلف نمايش دهند، اما متداول تر است كه آن را به كامپيوتر وصل كرده و براي آناليز داده ها از نرم افزار استفاده كنند و آن ‌را به صورت قابل كاربردي مانند نموداري از مقدار عبور يا مقدار جذب بر حسب طول موج نمايش مي دهند.

انواع ديگر اسپكتروفوتومتر:‌

تك پرتو و دو پرتو:
اسپكتروفوتومترها به دو دسته تقسيم مي شوند: تك پرتو و دو پرتو. اسپكتروفوتومترهاي تك پرتو اولين نسل اسپكتروفوتومترها بوده و تمام نور از بين نمونه عبور مي كنند. در اين نوع براي اندازه‌گيري شدت نور تابشي بايد به اين نكته توجه داشت. اين اسپكتروفوتومترها ارزان تر هستند چرا كه بخش هاي كمتري داشته و سيستم آن‌ها پيچيدگي كمتري دارند. نسل جديدتر اسپكتروفوتومترها نوع دو پرتو است. در اين نوع نور قبل از اينكه به نمونه برسد به دو پرتو مجزا تفكيك مي شود كه اين مسئله يك امتياز تلقي مي‌شود زيرا خواندن منبع و نمونه به صورت همزمان انجام مي‌شود. در برخي از اسپكتروفوتومترهاي دو پرتوي، دو آشكارساز وجود دارد بدين ترتيب امكان اندازه‌گيري همزمان پرتوهاي نمونه و مرجع فراهم مي شود. ساير اسپكتروفوتومترهاي دو پرتوي كه تنها يك آشكارساز دارند از برشگر پرتو استفاده مي كنندكه اين وسيله در هر لحظه يك پرتو را سد كرده و آشكارساز اندازه‌گيري پرتو نمونه و مرجع را به صورت يك در ميان انجام مي دهد.‌

نور مرئي:
محدوده نور مرئي حدود 700-400 نانومتر است. اسپكتروفوتومترهاي ناحيه مرئي دقت و صحت متغيري دارند. برخي از آن‌ها آشكارساز‌CCD با پيكسل‌هاي كافي براي قرائت هر‌‌nm10 را دارند، درحاليكه برخي ديگر مي‌توانند در هر نانومتر چندين قرائت انجام دهند. اين اسپكتروفوتومترها مي‌توانند از منابع نور سيمابي، هالوژن،LED يا تركيبي از اين منابع مثل LED تقويت شده با رشته‌هاي تنگستن استفاده كنند. ‌

نور ماوراء بنفش:
اسپكتروفوتومترUV ‌علاوه بر اينكه در طيف سنجي مايعات بسيار متداول است، براي گازها و همچنين جامدات نيز استفاده مي شود. نمونه را در محفظه مستطيلي مخصوص كه معمولا يك سانتي متر پهنا دارد قرار مي دهند. اين محفظه كه كاوت‌‌(cuvvette) ناميده مي شود مي‌تواند شكل پلاستيك، شيشه يا كوارتز داشته باشد. پلاستيك و شيشه‌، UV را جذب مي كنند از اينرو تنها مي‌توان آن‌ها را براي اسپكتروفوتومتري نور مرئي استفاده كرد.‌

نور مادون قرمز:
اسپكتروفوتومتر مادون قرمز در شناسايي مولكولي و ارتعاشات وابسته به ساختار آن استفاده مي شود.‌‌ ‌ساختارهاي شيميايي متفاوت، به دليل تفاوت در انرژي هاي مربوط به هر طول موج، راه‌هاي مختلفي در پاسخ به طول موج هاي مختلف دارند. به عنوان مثال مادون قرمز‌هاي برد متوسط، تمايل به لرزش دوراني دارد، درحاليكه مادون قرمز نزديك (با انرژي بالاتر) تمايل به لرزش هارمونيك مولكولي مانند جنبش دارد.‌
در اسپكتروفوتومترهاي‌IR متداول يك پرتو مادون قرمز مستقيما به نمونه مي تابد و تمام طول موج‌هاي طيف نسبت به پرتو مرجع اندازه‌گيري مي‌شود. به منظور توليد طيفي با كيفيت بالا، بايد پهناي طيف ورودي به آرامي اسكن شود. اسپكتروسكوپي‌IR با روش بسط تبديل فوريه اصلاح مي شود. قلب اسپكتروفوتومترهاي IR تداخل سنج ميشلسون است كه در شكل نشان داده شده است.

نور تابش شده از منبع‌IR به سمت سلول‌هاي نمونه هدايت مي شود. نيمي از پرتو تابشي از آينه ثابت باز تابيده شده و نيم ديگر آن از آينه اي كه مرتبا در فاصله اي حدود دو و نيم ميكرومتر حركت مي كند منعكس مي‌شود. هنگامي كه دوباره دو پرتو در آشكارساز با هم تركيب مي شوند و تداخل به وجود مي آيد، حدود دو ثانيه يك اسكن از فاصله ورودي گرفته شده و در كامپيوتر ذخيره مي شود. به همين ترتيب چندين اسكن ديگر نيز به طور همزمان به آن اضافه مي شود. با توجه به نوسانات و ارتعاشات حرارتي در آزمايشگاه بديهي است كه اين امر نا ممكن است. پس به منظور حل اين مشكل از ليزر هليم – نئون براي تاباندن به تداخل سنج ميشلسون استفاده مي شود و تداخل ليزر به عنوان فركانس مرجع به كار گرفته مي شود. كارائي‌FTIR از دستگاه‌هاي معمولي بيشتر است كه مي‌توان تنها با مقدار كمي از نمونه و در زماني كوتاه به طيفي عالي دست يافت.
استفاده از اسپكتروفوتومتر:

اسپكتروفوتومترها مستقيما براي اندازه‌گيري شدت نور در طول موج هاي مختلف استفاده مي شود و مي‌تواند نماينده درصد نور تابشي مخابره شده يا جذب شده باشد. با استفاده از اين اطلاعات و مقايسه آن با دانسيته‌ها و داده‌هاي به دست آمده مي‌توان اسپكتروسكوپي را به عنوان يك ابزار استفاده كرد. مقايسه طيف‌ها براي تعيين غلظت جسم حل شده موجود در حلال مثال خوبي است. بدين ترتيب كه با ثبت نور ارسال و دريافت شده در طول موجي خاص و بررسي طول موج جذب شده توسط حلال مي‌توان به غلظت آن پي برد. سپس آناليز محلول با غلظت ناشناخته، با داده هاي معلوم مقايسه شده و به كمك تناسب غلظت محاسبه مي‌شود. اين عمل براي محلول‌هايي كه در آن‌ها چندين نوع حلال وجود دارد نيز قابل استفاده است والبته به دقت بيشتري در آناليز طول موج ها احتياج دارد. با توجه به حساسيت اسپكتروفوتومتر‌FTIR مناسب ترين و رضايت بخش ترين روش آماده سازي نمونه، تبخير ساده محلول نمونه در صفحه اي از نمك ‌‌ KBr و دست يافتن به طيفهاي فيلم نازك باقي مانده است. اين روش طيفي بسيار خوب با خط مبداء مسطح به ‌وجود ميآورد.‌
شکل زيرساختار اپتيک دستگاه اسپکتروفوتومتر را نشان میدهد:

اسپكتروفوتومترهايي كه منبع نور ندارند اما طيف‌هاي مبني بر نور وارده را توليد مي كنند مي‌توانند با روشي مشابه براي تعيين منبع نور استفاده شوند. مي‌توان منحني طيف‌هاي به دست آمده از منبع نوري نامعلوم (يا تركيبي از منابع) را با اطلاعات منحني هاي منبع نور مشخصي مقايسه كرد و منبع نور ناشناخته را شناسايي كرد.‌
از ديگر كاربردهاي اسپكتروفوتومتر مي‌توان به تعيين ثابت موازنه واكنش هاي يوني كه در محلول‌هاي آبي انجام مي شود اشاره كرد. در ابتدا طيف‌هاي محلولي كه تنها شامل يك واكنش دهنده است اندازه‌گيري مي شود. سپس ديگر واكنش دهنده‌ها به آن اضافه مي شود و پس از هر بار افزايش، طيف سنجي صورت مي گيرد. اين روش در صورتي به صورت مطلوب كار مي كند كه طول موج جذب شده توسط محصول مقداري مشخص باشد. از آنجا‌كه بيشتر محصولات از اضافه كردن چندين واكنشگر به دست ميآيند، زماني كه محلول اشباع شده و واكنش موازنه مي شود نورهاي بيشتري جذب شده و افزايش نور جذب شده برابر ثابت موازنه است. ‌
در هنگام نصب دستگاه اسپكتروفوتومتر بايد به نكات زير توجه داشت:
1- اسپكتروفوتومتر بايد روي سطحي سفت و‌ در محيطي خشك و تميز نصب شود.‌
2- به جهت امكان جريان هوا در اطراف اسپكتروفوتومتر ، بايد بين دستگاه و ديوارهاي اطراف 50 ميليمتر فاصله باشد.‌
3- كابل برق دستگاه به پريز گراند شده با ولتاژ مناسب وصل شود.‌
4- پس از اتصال آداپتور‌AC به برق، خروجي آن بايد به گونه اي به دستگاه وصل شود كه منبع ذخيره‌DC در مسير آن قرار گيرد.‌
5- در صورتي كه خود دستگاه فاقد پرينتر است، بايد از طريق پورت مخصوص آن‌را به پرينتر وصل كرد.‌
6- پس از روشن كردن دستگاه مدتي صبر كرده تا دستگاه گرم شده و به پايداري حرارتي و الكترونيكي برسد.‌

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

شما می‌توانید از این دستورات HTML استفاده کنید: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>